Портал | Содержание | О нас | Авторам | Новости | Первая десятка | Дискуссионный клуб | Чат Научный форум --> Первая десятка "Русского переплета" Темы дня:

Президенту Путину о создании Института Истории Русского Народа. |Нас посетило 40 млн. человек | Чем занимались русские 4000 лет назад?

| Кому давать гранты или сколько в России молодых ученых?

Описаны строение некоторых внутриклеточных Са-связывающих белков и изменения, происходящие в структуре этих белков при связывании Са2+. Приведены примеры участия кальмодулина в регуляции внутриклеточных процессов. Показан один из возможных путей регуляции активности белков-мишеней под действием кальмодулина.

Са-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ

Часть 2. Структура и механизм функционирования

Н. Б. ГУСЕВ

Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ

Многочисленные процессы, протекающие внутри клетки, находятся под контролем специальных регуляторных систем. Эти системы ускоряют течение одних реакций и тормозят другие, способствуют или, наоборот, препятствуют движению клеток в определенном направлении, влияют на способность клеток общаться друг с другом. Внутриклеточные регуляторные системы достаточно универсальны. Эти системы способны воспринимать как сигналы о функционировании данной изолированной клетки, так и сигналы, приходящие к данной клетке от других органов и тканей. Разнообразные внутри- и внеклеточные сигналы трансформируются регуляторными системами и преобразуются в локальные изменения концентрации ограниченного числа специальных молекул, способных кардинально влиять на функционирование клетки. К числу таких универсальных внутриклеточных регуляторов относятся ионы кальция.

В состоянии покоя специальные транспортные системы, встроенные во внешние или внутренние мембраны клетки, активно выкачивают Са2 + из цитоплазмы. Поэтому в состоянии покоя уровень свободного кальция в цитоплазме клетки составляет 10- 7-10- 6 М. При возбуждении происходит резкое изменение внутриклеточной концентрации кальция. Са2 + входит внутрь клетки из внеклеточного пространства или освобождается из внутриклеточных запасов. Следствием этого является увеличение концентрации Са2 + в цитоплазме до 10- 5 М. Ионы кальция связываются специальными внутриклеточными Са-связывающими белками. Часть этих белков относится к белкам семейства EF-руки. Белки этого семейства имеют специально устроенные центры связывания кальция. Центральный элемент такого центра - Са-связывающая петля, состоящая из 12 аминокислотных остатков, часть из которых содержит в своей боковой цепи атомы кислорода. Са2 + оказывается расположенным в центре октаэдра (две четырехгранные пирамиды, соединенные основаниями) и удерживается в этом положении за счет взаимодействия с шестью кислородсодержащими лигандами, расположенными в вершинах октаэдра (см. статью [5] в этом номере). С обеих сторон от Са-связывающей петли располагаются a-спиральные участки, поэтому структура изолированного Са-связывающего участка имеет вид спираль-петля-спираль. При анализе кристаллической структуры две спирали Са-связывающей петли были уподоблены указательному и большому пальцам правой руки и обозначены соответственно буквами Е и F, а вся структура стала называться EF-рукой. В статье [5] приведены примеры Са-связывающих белков, содержащих в своем составе от двух до шести катионсвязывающих петель. За счет своей структуры с правильным расположением остатков кислородсодержащих аминокислот EF-рука обеспечивает высокоэффективное и специфичное связывание Са2 +. Часть Са-связывающих белков выполняет функции переносчика кальция или функционирует в качестве своеобразного буфера, поддерживающего концентрацию Са2 + в цитоплазме на низком уровне. Таким белкам достаточно просто связывать кальций. Другие же белки выступают в роли регуляторов и должны в зависимости от концентрации Са2 + по-разному взаимодействовать со своими белками-мишенями, чью активность они должны регулировать.

ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА

Са-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ EF-РУКИ

Как уже упоминалось, наиболее просто устроенные Са-связывающие белки содержат в своей структуре два Са-связывающих центра. К этой группе относится подробно изученный белок кишечника, получивший название кальбиндин или витамин-D-индуцируемый белок кишечника. Синтез кальбиндина в клетках кишечника усиливается при добавлении витамина D. Увеличение содержания кальбиндина способствует улучшению сорбции кальция и препятствует развитию рахита, при котором в организме животного не хватает кальция для правильного формирования костей. Таким образом, кальбиндин выполняет функции своеобразного транспортера кальция и обеспечивает поглощение кальция из пищи и его использование для нужд организма. Кальбиндин имеет маленькую молекулярную массу (9000 Да) и компактную глобулярную форму (рис. 1). Полипептидные цепи двух Са-связывающих петель расположены антипараллельно друг относительно друга и ограничены с двух сторон a-спиральными участками. В каждом Са-связывающем центре a-спиральные участки ориентированы перпендикулярно друг к другу, то есть расположены так, как отставленные большой и указательный пальцы на руке. Связывание кальция не сопровождается значительными изменениями в структуре кальбиндина, и взаимная ориентация спиралей и петель не претерпевает существенных изменений. В данном случае изменение структуры белка не столь важно, потому что главной функцией кальбиндина являются связывание и удержание кальция, а не передача сигнала о повышении концентрации кальция на другие белки.

Более сложно устроенные Са-связывающие белки содержат в своей структуре четыре катионсвязывающих центра. Примерами таких белков являются кальмодулин и тропонин С. В изолированном состоянии эти белки часто имеют форму гантели (см. рис. 1). Два шара этой гантели содержат по два катионсвязывающих центра и напоминают структуру изолированного кальбиндина (рис. 1, а). Между двумя шарами гантели находится "ручка", образованная длинной a-спиралью. Общая структурная организация Са-связывающих участков кальмодулина и тропонина С похожа на организацию Са-связывающих участков в структуре кальбиндина. Действительно, полипептидные цепи Са-связывающих петель идут антипараллельно друг относительно друга (это особенно хорошо видно при сравнении структуры кальбиндина с С-концевой частью кальмодулина (см. рис. 1)), а a-спирали, ограничивающие Са-связывающие петли, ориентированы перпендикулярно друг относительно друга (рис. 1). Однако на этом сходство между кальмодулином (и тропонином С), с одной стороны, и кальбиндином - с другой, заканчивается. Дело в том, что в отличие от кальбиндина, главной функцией которого является простое связывание Са2 +, кальмодулин и тропонин С участвуют в передаче кальциевого сигнала. Передача же сигнала становится возможной только в том случае, если в ответ на связывание Са2 + происходят какие-то изменения в структуре белка и эти перестройки узнаются другими белками-партнерами, которые смогут преобразовать изменение концентрации Са2 + в увеличение или уменьшение ферментативной активности, генерацию движения или какую-то иную важную для функционирования клетки активность. Именно поэтому внутриклеточные белки-регуляторы (или, как их иногда называют, белки-триггеры) должны в ответ на связывание Са2 + довольно существенно изменять свою структуру.

Последние достижения в области рентгеноструктурного анализа, а также метода ядерного магнитного резонанса позволили более подробно описать структурные перестройки (так называемые конформационные изменения), происходящие при связывании Са2 + с некоторыми регуляторными белками. Было предположено, а потом доказано экспериментально, что связывание Са2 + часто сопровождается переориентацией (переупаковкой) петель и спиралей в структуре белка.

Рассмотрим в качестве примера упоминавшийся выше тропонин С. На рис. 2, а изображена модель тропонина С, в котором два С-концевых (нижних на рис. 2, а) Са-связывающих центра насыщены кальцием (изображен в виде двух маленьких шариков), а два N-концевых (верхних на рис. 2, а) центра не содержат кальция. Видно, что в таком состоянии общая структура С-концевой глобулярной части тропонина С отличается от структуры N-концевой глобулярной части. Действительно, спирали G и F, а также соединяющая их петля ориентированы почти перпендикулярно к центральной спирали тропонина С. В то же время спирали В и С в верхней части молекулы белка расположены почти параллельно центральной a-спирали, а петля, соединяющая эти спирали, контактирует с центральной спиралью. Связывание кальция первым и вторым катионсвязывающими центрами приводит к тому, что структура N-концевой части тропонина С становится похожей на структуру его С-концевой части: спирали В и С ориентируются перпендикулярно центральной a-спирали, а петля, соединяющая спирали В и С, удаляется от центральной спирали (рис. 2, б ). Все эти перемещения в структуре тропонина С можно сравнить с функционированием семафора. Положение рук сигнальщика на мостике корабля или взаимная ориентация подвижных частей железнодорожного семафора позволяют кодировать и передавать довольно широкий набор команд. Так, и в случае кальмодулина и тропонина С опущенные вниз и идущие параллельно длинной оси белка спирали В и С означают, что белок свободен от кальция, то есть клетка пребывает в состоянии покоя и нет нужды предпринимать какие-то экстренные действия. Поднятые вверх и ориентированные перпендикулярно длинной оси молекулы белка спирали В и С говорят о том, что Са-связывающий белок насыщен кальцием. Насыщение кальцием регуляторных центров свидетельствует о том, что пришел какой-то внутри- или внеклеточный сигнал, клетка вышла из состояния покоя и необходимо предпринимать какие-то срочные действия для того, чтобы она могла вернуться в свое исходное состояние. Рассмотрим, каким образом изменение структуры одного из Са-связывающих белков приводит к регуляции различных внутриклеточных процессов.

МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ Са-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ КАЛЬМОДУЛИНА

Кальмодулин, один из наиболее подробно изученных Са-связывающих белков, широко распространен и встречается в клетках животных, растений и грибов. Широкая распространенность обусловлена, вероятно, тем, что кальмодулин способен регулировать большое количество (более 30 описанных к настоящему времени) различных процессов, происходящих в клетке. Этот факт отражен в названии. Кальмодулин - белок, способный кальцийзависимым образом регулировать (модулировать) активность других белков. Рассмотрим некоторые процессы, регулируемые кальмодулином.

На рис. 3 показана схема, иллюстрирующая основные пути, по которым осуществляется действие кальмодулина. При повышении внутриклеточной концентрации Са2 + происходит его связывание с кальмодулином. Кальмодулин изменяет свою структуру и оказывается способным влиять на активность белков-мишеней. В качестве мишеней могут выступать ферменты, вовлеченные в метаболизм циклических нуклеотидов - циклической АМФ и циклической ГМФ (рис. 3). При этом кальмодулин способен влиять как на активность ферментов, участвующих в синтезе циклических нуклеотидов (аденилатциклаза, NO синтаза), так и на активность ферментов, разрушающих циклические нуклеотиды (фосфодиэстеразы). Система циклических нуклеотидов (наравне с кальцием) является универсальной управляющей системой клетки. Под контролем этой системы находятся протеинкиназы - ферменты, способные переносить остаток фосфата с молекулы АТФ на определенные участки в структуре белка и тем самым менять структуру и свойства белков-субстратов. Таким образом, кальмодулин как бы связывает две универсальные регуляторные системы клетки: систему, зависящую от циклических нуклеотидов, и систему, управляемую ионами кальция.

Кальмодулин может регулировать активность структурных белков цитоскелета (рис. 3), связанных с микротрубочками и микрофиламентами. Таким способом кальмодулин может оказывать влияние на процессы эндо- и экзоцитоза, а также на перемещение органелл внутри клетки или изменение формы клетки.

Кальмодулин является субъединицей и регулирует активность многих Са-зависимых протеинкиназ (рис. 3). Эти ферменты, так же как ранее упомянутые протеинкиназы, зависящие от циклических нуклеотидов, переносят остаток фосфорной кислоты от АТФ на определенные участки в структуре белков-субстратов.

Кальмодулин способен регулировать активность некоторых протеинфосфатаз (рис. 3). Эти ферменты являются антагонистами протеинкиназ. Фосфатазы узнают в структуре белка участки, фосфорилированные протеинкиназами, и удаляют из них остатки фосфата. Таким образом, фосфатазы как бы обращают эффект протеинкиназ.

Наконец, кальмодулин может взаимодействовать и активировать функционирование встроенной в наружную мембрану клетки транспортной АТФазы - фермента, способного за счет энергии гидролиза АТФ выбрасывать из клетки ионы Са2 + (рис. 3). Таким образом, кальмодулин осуществляет регуляцию по принципу отрицательной обратной связи. Повышение внутриклеточной концентрации кальция является сигналом тревоги. Как только такой сигнал поступает в клетку, необходимо задействовать системы по "уборке" Са2 +. Одной из таких систем является Са-АТФаза плазматических мембран, которая активируется насыщенным кальцием кальмодулином. Таким образом, кальмодулин является активным участником "тушения" кальциевого сигнала.

Даже этот далеко не полный перечень свидетельствует о том, что кальмодулин может регулировать активность разных белков. Возникает вопрос, каким образом этот сравнительно маленький белок (молекулярная масса кальмодулина около 18 000 Да) способен узнавать и регулировать десятки различных белков. Оказалось, что в структуре многих белков-мишеней кальмодулина есть специфические участки. Они сильно различаются по последовательности и составу аминокислот. Однако для всех этих участков характерны три основных свойства. Во-первых, все они склонны к образованию a-спирали, во-вторых, указанные участки обогащены остатками положительно заряженных аминокислот (таких, как лизин и аргинин), и, в-третьих, половина цилиндрической поверхности таких a-спиральных участков густо покрыта положительно заряженными остатками аминокислот, а вторая половина цилиндрической поверхности - аминокислотными остатками с гидрофобными боковыми цепями. Таким образом, в структуре многих белков-мишеней кальмодулина есть так называемые амфифильные a-спирали. Эти спирали можно сравнить с двуликим Янусом. Половина их поверхности полярна, положительно заряжена и охотно контактирует с водой. Вторая половина такой a-спирали покрыта жирными водоотталкивающими радикалами, которые стремятся спрятаться от воды и предпочтительно взаимодействуют с себе подобными гидрофобными радикалами. Почему такая структура в составе молекулы белка является удобной посадочной площадкой для кальмодулина?

Связывание Са2 + катионсвязывающими центрами кальмодулина сопровождается такими же изменениями структуры белка, которые были описаны для связывания Са2 + с тропонином С (см. рис. 2). Связывание кальция приводит к удалению спиралей В и С были от центральной спирали кальмодулина. При этом открываются гидрофобные поверхности, которые раньше были спрятаны из-за того, что спирали В и С были прижаты к центральной спирали. Таким образом, индуцированное кальцием перемещение спиралей приводит к возникновению гидрофобных поверхностей как в N-, так и в С-концевых глобулярных участках кальмодулина. На рис. 4 глобулярные участки кальмодулина представлены в виде полусфер, а сформировавшиеся под действием Са2 + гидрофобные области отмечены штриховкой. Итак, под действием Са2 + в структуре кальмодулина появились две гидрофобные области, пространственно удаленные друг от друга, стремящиеся избежать контакта с водой и ищущие партнера, имеющего такие же неприкрытые гидрофобные участки. Очевидно, что в таком состоянии кальмодулин будет охотно взаимодействовать с гидрофобной поверхностью амфифильной спирали белка-мишени. Особенно прочный контакт между белком-мишенью и кальмодулином (имеющим гидрофобные центры, пространственно удаленные друг от друга) станет возможным в том случае, если центральная спираль кальмодулина "расплавится" и изогнется, а две гидрофобные поверхности кальмодулина как бы обнимут амфифильную спираль белка-мишени (см. рис. 4, б ). При таком расположении гидрофильная, положительно заряженная поверхность амфифильной a-спирали белка-мишени сможет контактировать с отрицательно заряженными остатками "расплавленной" и изогнутой центральной спирали кальмодулина (рис. 4, б ).

Таким образом, в описываемом случае связывание Са2 + приводит к экспонированию гидрофобных участков на поверхности кальмодулина. Это способствует взаимодействию насыщенного кальцием кальмодулина со спиральным участком белка-мишени. При этом прочный контакт между белком-мишенью и кальмодулином становится возможным только после "плавления" и изгиба центральной спирали кальмодулина. Следует сразу оговориться, что такой способ взаимодействия кальмодулина с белками-мишенями широко распространен, однако не является единственно возможным. Почти наверняка можно утверждать, что в некоторых случаях кальмодулин взаимодействует с белками-мишенями в распрямленной конфигурации. В таком случае кальмодулин прикрепляется к белку-мишени иным, до сих пор не вполне понятным образом.

Вернемся к подробно изученным белкам-мишеням, имеющим в своем составе кальмодулинсвязывающий участок в виде амфифильной a-спирали, и зададимся вопросом, каким образом связывание кальмодулина может влиять на свойства белка-мишени. В настоящее время детально исследована структура нескольких кальмодулинзависимых протеинкиназ, кальмодулинзависимой транспортной АТФазы плазматических мембран и кальмодулинзависимой фосфатазы (кальцинейрина). При всем разнообразии в структуре этих ферментов можно выделить два крупных участка или домена (под доменом понимается автономно укладывающийся сравнительно крупный участок в структуре белка). В одном домене располагается активный центр фермента. Этот центр способен связывать субстрат и осуществляет все каталитические превращения субстрата. Каталитический домен с помощью гибкого шарнирного участка соединен с меньшим по размеру регуляторным участком (рис. 5). Регуляторный домен не обладает каталитической активностью, но, как правило, содержит в своем составе участок, похожий по структуре на субстрат, подвергающийся превращениям в каталитическом центре фермента. Этот участок часто называют псевдосубстратным. В неактивном состоянии каталитический и регуляторный домены фермента контактируют друг с другом и псевдосубстратный участок оказывается расположенным в активном центре белка (рис. 5). В таком состоянии активный центр фермента недоступен для настоящего субстрата и такой фермент неспособен катализировать характерную для него реакцию. Оказалось, что в ингибиторном домене многих кальмодулинзависимых ферментов псевдосубстратный участок располагается поблизости или даже частично перекрывается с участком связывания кальмодулина. При повышении концентрации Са2 + в цитоплазме кальмодулин связывает кальций. Связывание кальция приводит к изменению структуры кальмодулина, и он оказывается способным взаимодействовать с регуляторным доменом фермента-мишени (рис. 5). Взаимодействие с кальмодулином приводит к тому, что регуляторный домен удаляется от каталитического домена и вследствие этого открывается каталитический центр фермента. В таком состоянии субстрат может проникать в активный центр и фермент оказывается способным катализировать характерную для него реакцию.

Функционирование фермента приводит к накоплению тех или иных продуктов реакции и определенному изменению в состоянии клетки. Как только концентрация ионов кальция в цитоплазме уменьшается, Са2 + диссоциирует из катионсвязывающих центров кальмодулина. Кальмодулин диссоциирует из комплекса с регуляторным участком фермента, псевдосубстратный участок занимает свое положение в активном центре фермента и выключает фермент. Таким образом, изменение концентрации Са2 + в цитоплазме с помощью кальмодулина преобразуется в изменение ферментативной активности некоторых ферментов. Как уже отмечалось, кальмодулин может регулировать активность ферментов-антагонистов. Например, кальмодулин активирует протеинкиназы (ферменты, переносящие остатки фосфата на определенные группы в структуре белка) и фосфатазы (ферменты, удаляющие остатки фосфата, перенесенные протеинкиназами). При одновременной активации обоих типов ферментов будет происходить бессмысленная трата АТФ, при этом не будет происходить никакой регуляции процессов, протекающих в клетке. Такой беспорядок в клетке недопустим. Существуют несколько механизмов, делающих невозможным одновременное протекание таких взаимоисключающих реакций. Каждая клетка разбита как бы на несколько отсеков, и изменение концентрации кальция происходит не во всем объеме цитоплазмы, а лишь в определенных ее участках. Ферменты, регулируемые кальмодулином, также распределены неравномерно. Некоторые ферменты в основном располагаются в одних, а другие ферменты - в других отсеках. Кальмодулинзависимые ферменты различаются по своему сродству к кальмодулину. Одни ферменты могут активироваться кальмодулином, связавшим только два иона кальция, а для активации других ферментов необходимо, чтобы все четыре катионсвязывающих центра кальмодулина были насыщены кальцием. Таким образом, несмотря на то что сформировались общие представления о механизме регуляции активности ферментов кальмодулином, многие детали этого процесса остаются не вполне понятными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Са2 + является одним из немногих универсальных регуляторов жизнедеятельности клетки. В состоянии покоя в цитоплазме клетки поддерживается низкая концентрация Са2 +. В ответ на внутри- или внеклеточные сигналы происходит кратковременное локальное увеличение концентрации Са2 +. Ионы кальция взаимодействуют с внутриклеточными Са-связывающими белками. Часть этих белков обеспечивает перенос Са2 + внутри клетки или выступает в качестве своеобразного буфера, поддерживающего низкий уровень Са2 + внутри клетки. Связывание Са2 + такими белками не сопровождается значительными изменениями их структуры. Другие белки выполняют регуляторные функции. В этом случае связывание Са2 + приводит к довольно заметным изменениям структуры белка. Зачастую связывание Са2 + сопровождается структурными изменениями, в ходе которых на поверхности Са-связывающего белка экспонируются гидрофобные участки. С помощью этих участков Са-связывающие белки взаимодействуют с различными белками-мишенями и регулируют их активность. Следствием изменения активности белков-мишеней являются различные клеточные ответы, такие, как изменение формы клеток или ее перемещение в пространстве, ускоренный синтез АТФ или каких-то иных соединений, срочно необходимых клетке в данный момент, переход от состояния покоя в состояние ускоренного деления и т.д. Как только за счет действия специальных транспортных АТФаз уровень Са2 + в цитоплазме понизится до исходного уровня, характерного для состояния покоя, ионы Са2 + диссоциируют от Са-связывающих белков. Эти белки перестают взаимодействовать со своими белками-мишенями, и клетка переходит в состояние покоя.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Kawasaki H., Kretsinger R. // Protein Profile. Calcium-binding Proteins. 1. 1994. Vol. 1. P. 343-390.

2. Herzberg O., Moult J., James M.N.G. A Model for the Ca2 +-induced Conformational Transition of Troponin C: A Trigger for Muscle Contraction // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 2638-2644.

3. Kretsinger R. Calmodulin and Myosin-light Chain Kinase: How Helices are Bent // Science. 1992. Vol. 258. P. 50-51.

4. Crivici A., Ikura M. Molecular and Structural Basis of Target Recognition by Calmodulin // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. Vol. 24. P. 85-116.

5. Гусев Н.Б. Ca-связывающие белки. Часть 1. Классификация и строение // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. ╧ 5. 2-9.

* * *

Николай Борисович Гусев, доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии биологического факультета МГУ. Область научных интересов - биохимия мышц. Автор более 90 научных работ.