Портал | Содержание | О нас | Авторам | Новости | Первая десятка | Дискуссионный клуб | Чат Научный форум --> Первая десятка "Русского переплета" Темы дня:

Президенту Путину о создании Института Истории Русского Народа. |Нас посетило 40 млн. человек | Чем занимались русские 4000 лет назад?

| Кому давать гранты или сколько в России молодых ученых?

Взаимодействие различных Са-каналов с системами активного транспорта и Са-связывающими белками приводит к осцилляции цитоплазматической концентрации Са2 +. Частота этой осцилляции возрастает под действием внеклеточных стимулов (гормонов, факторов роста, механического раздражения клетки). Многие Са-зависимые эффекты (подвижность, секреция, биосинтез и др.) оказываются пропорциональными частоте осцилляции ионов Са2 + в цитоплазме.

И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ КАЛЬЦИЙ

В. А. ТКАЧУК

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ

В морской воде, где, вероятно, зарождалась жизнь, ионы Са2 + и Mg2 + присутствуют в сравнительно близких концентрациях (соответственно 11 и 55 мМ). Близко их содержание и в плазме крови человека (соответственно 2,5 и 0,9 мМ). При этом около половины кальция в плазме связано с органическими фосфатами и белками, поэтому свободных ионов Са2 + в крови оказывается только 1,2 мМ. Внутри же клетки, в ее цитоплазме, концентрация ионов Са2 + в 10 000 раз меньшая - около 100 нМ. Магния в цитоплазме в 10 раз больше, чем в крови, то есть около 10-15 мМ, однако он более чем на 90% связан с нуклеотидами и другими полианионами клетки, вследствие чего концентрация свободных ионов Mg2 + в цитоплазме почти такая же, как в крови. Комплексы магния с нуклеотидами, фосфолипидами, нуклеиновыми кислотами и фосфосахарами часто являются истинными субстратами ферментов, а свободный Mg2 + может выполнять роль кофактора соответствующего метаболического процесса.

Кальций в цитоплазме не может образовывать комплексы с метаболитами, так как его концентрация очень низка. Он редко является кофактором ферментативных реакций, хотя может регулировать многие метаболические процессы, активируя специфические Са-связывающие белки. Основная функция Ca2 + заключается в передаче регуляторных сигналов.

Клетка не может жить как без Mg2 +, так и без Са2 +, однако продолжительное (в течение десятков минут) повышение уровня Са2 + в цитоплазме (от 10- 7 до 10- 5 М и выше) приводит к гибели клеток. В мембранах клетки функционируют сложно организованные белковые структуры, обеспечивающие вход Са2 + в цитоплазму по градиенту его концентрации (Са2 +-каналы), а также селективные системы активного транспорта Са2 + против градиента его концентрации, использующие для этого либо энергию АТФ (Са-насос), либо градиенты других ионов (например, Na / Ca-переносчик). Согласованное функционирование систем пассивного и активного транспорта Са2 + через цитоплазматическую и внутриклеточные мембраны обеспечивает так называемое транзиторное повышение концентрации Са2 +, то есть способность цитоплазматического Са2 + возвращаться к базальному уровню вне зависимости от того, продолжает ли действовать сигнал, вызвавший вход Са2 + в клетку.

В статье охарактеризованы основные механизмы возникновения Са2 +-зависимого сигнала, его проведения через мембрану и реализации в физиологический ответ клетки.

ВХОД Са2 + В ЦИТОПЛАЗМУ

В таких невозбудимых клетках, как клетки крови, гепатоциты или эндотелий, вход Са2 + в цитоплазму из внеклеточного пространства или эндоплазматического ретукулума происходит за счет активации фосфолипазы С, гидролизующей фосфоинозитиды (рис. 1). Это минорные фосфолипиды клетки, гидрофильная часть которых представлена шестиуглеродным спиртом инозитолом. В составе липида инозитол может фосфорилироваться по положениям 1, 4 и 5, в результате чего образуется трифосфоинозитид (ТФИ), служащий хорошим субстратом для фосфолипазы С. Гидролизуя ТФИ, фосфолипаза С образует два вторичных посредника (рис. 1). Один из них, инозитол 1,4,5-трисфосфат (Ин-1,4,5-Ф3), легко диффундируя к эндоплазматическому ретикулуму, связывается там со своим рецептором-каналоформером, что приводит к выходу Са2 + из ретикулума (рис. 2). Вторая часть молекулы ТФИ - диацилглицерин (ДАГ) остается в плазматической мембране клетки. Связываясь там с киназой С (протеинкиназой, фосфорилирующей многие белки цитоскелета, хроматина и мембран), ДАГ повышает сродство этой киназы к Са2 +, что приводит к активации процессов фосфорилирования в клетке. Ионы Са2 +, вышедшие из ретикулума или вошедшие в клетку извне, взаимодействуют со специфическими Са-связывающими белками, тем самым влияя на метаболическое и функциональное состояние клетки (см. рис. 2).

С помощью этого механизма уровень Са2 + в цитоплазме обычно возрастает от 10- 7 до 10- 6 М. Повышение концентрации Са2 + в клетках вызывают два класса регуляторов, стимулирующих разные изоформы фосфолипазы С: гормоны и факторы роста. Гормоны, связываясь с рецепторами, имеющими семь трансмембранных доменов, и сопряженными с ГТФ-связывающими G-белками, активируют мембранную b-изоформу фосфолипазы С. Эта активация осуществляется за счет того, что молекула гормона, связываясь с рецептором, сообщает ему сродство к соответствующему G-белку. Образование комплекса между рецептором и G-белком приводит к замещению в активном центре последнего ГДФ на ГТФ, в результате чего G-белок активируется и связывается с фосфолипазой С, тем самым переводя ее из неактивного в каталитически активное состояние. Гидролиз ТФИ этой фосфолипазой приводит к образованию Ин-1,4,5-Ф3 и ДАГ (см. рис. 2). Подобным образом действуют на клетку адреналин и норадреналин (через a-1-адренергические рецепторы), ацетилхолин (через М-1, М-3 и М-5 мускариновые холинорецепторы), экзогенные нуклеотиды (через Р2у и Р2t пуринергические рецепторы), серотонин (через 5-НТ-1С рецептор), вазопрессин (через V-1a и V-1b рецепторы) и многие другие гормоны.

Помимо b-изоформы фосфолипазы С в клетках обычно функционирует также g-изоформа этого фермента, которая не может взаимодействовать с G-белками или 7-доменными рецепторами гормонов, но служит замечательным субстратом так называемых тирозиновых киназ, то есть протеинкиназ, способных фосфорилировать ОН-группу аминокислоты тирозина в составе белка. Тирозиновыми киназами являются рецепторы многих факторов роста. Эти регуляторные внеклеточные белки, взаимодействуя со своими рецепторами на цитоплазматической мембране, стимулируют деление клеток, синтез и секрецию белков, изменяют морфологию и другие свойства клеток. Рецепторы факторов роста обычно бифункциональны - один и тот же полипептид имеет рецепторный домен, локализованный снаружи клетки, и внутриклеточный домен, который приобретает каталитическую активность (способность фосфорилировать белки) при взаимодействии фактора роста с внеклеточным доменом этого рецептора. Фосфорилирование g-изоформы фосфолипазы С по тирозиновому остатку приводит к ее активации, в результате чего из ТФИ образуются Ин-1,4,5-Ф3 и ДАГ (см. рис. 2).

Возбудимые клетки (нейроны, мышечные волокна) также воспринимают регуляторное влияние Са-мобилизующих гормонов и факторов роста, однако помимо фосфоинозитидного пути регуляции уровня Са2 + они имеют потенциалзависимые Са2 +-каналы (рис. 3), благодаря чему происходит вход Са2 + в клетку при деполяризации мембраны. Снижение потенциала покоя в возбудимой мембране, равного около - 70 мВ, воспринимается специальным сенсором в составе Са2 +-канала и при некоторой пороговой величине приводит к изменению конформации потенциалзависимого Са2 +-канала, в результате он открывается и через пору размером 5 Б внутрь клетки устремляются ионы Са2 + со скоростью около миллиона ионов в секунду.

Следует отметить, что в некоторых тканях, например в сердце, потенциалзависимый Са-канал может регулироваться также G-белками или путем фосфорилирования (не по тирозиновым, а по сериновым и треониновым остаткам; такое фосфорилирование катализирует цАМФ-зависимая протеинкиназа). Как фосфорилирование, так и взаимодействие с G-белком не могут вызвать открывание потенциалзависимого Са2 +-канала, но увеличивают время существования этого канала в открытом состоянии, иными словами, изменяют количество ионов Са2 +, вошедших в клетку при деполяризации мембраны. Этот канал имеет три разных участка связывания, через которые он тормозится так называемыми Са-антагонистами, лекарствами (верапамил, дилтиазем и дигидропиридины), широко используемыми в последнее десятилетие для лечения кардиологических, психотропных, аллергических и других заболеваний.

УДАЛЕНИЕ Са2 + ИЗ ЦИТОПЛАЗМЫ

При входе Са2 + в цитоплазму через Са2 +-канал включаются системы обратных связей, которые блокируют работу этих каналов. Инактивацию каналов могут вызывать ионы Са2 +, протеинкиназа С и другие регуляторные системы клетки. Удаление Са2 + из клетки осуществляет Са-насос плазматической мембраны. При повышенной концентрации Са2 + в цитоплазме работа этого насоса ускоряется за счет более полного насыщения переносчика ионами Са2 +.

В мембранах эндоплазматического ретикулума также функционирует Са-насос. По кинетическим свойствам он подобен насосу цитоплазматической мембраны: чем выше уровень Са2 + в цитоплазме (вплоть до 5 " 10- 6 М), тем быстрее Са2 + удаляется в цистерны ретикулума. Внутри этих цистерн Са2 + связывается с кальсеквестрином, белком, имеющим большое число Са-связывающих участков. Концентрация свободных ионов Са2 + внутри ретикулума может достигать 1 мМ.

Митохондриальная система устранения Са2 + из цитоплазмы имеет значение только при крайне высоком уровне Са2 + в цитоплазме - 10- 5 М и выше, что наблюдается при некоторых патологиях или других критических ситуациях в жизни клетки (перекисное окисление липидов, механическое повреждение мембраны). Переносчик Са2 + в митохондриях, имеющий очень низкое сродство к Са2 +, функционирует за счет электрохимического градиента, генерируемого переносом протонов. В митохондриальном матриксе Са2 + может накапливаться до концентрации 0,5 мМ.

ОСЦИЛЛЯЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО Са2 +

В цитоплазматической мембране клетки обычно функционируют несколько типов Са2 +-каналов. Так называемые рецепторуправляемые каналы могут быть стимулированы путем прямого сопряжения с G-белком, который переведен в активированную форму мембранным рецептором (см. рис. 3). Показано также существование в плазматической мембране Са-каналов, открываемых Ин-1,4,5-Ф3 , который образуется при стимуляции фосфоинозитидного обмена. Описаны Са2 +-активируемые Са2 +-каналы, которые модулируются еще одним продуктом фосфоинозитидного обмена - Ин-1,3,4,5-Ф4 (см. рис. 2). Еще более загадочно функционирование в плазматической мембране Са2 +-канала, активируемого путем выхода Са2 + из эндоплазматического ретикулума (см. рис. 3). Этот канал высоко селективен в отношении Са2 +, но имеет в 1000 раз меньшую проводимость, чем другие каналы. Как и другие Са2 +-каналы, при повышении уровня Са2 + в цитоплазме он инактивируется.

Ни один из этих Са2 +-каналов, управляемых рецептором, не удалось выделить в виде гомогенного белка или комплекса белков, они до сих пор не клонированы, неизвестна и структура их генов. Это объясняется крайне низким содержанием этих белков в тканях, а также, вероятно, их сложной олигомерной структурой. Наиболее изучен потенциалзависимый Са2 +-канал (см. рис. 3): известна структура всех его субъединиц, участков связывания органических блокаторов, сенсора мембранного потенциала, описан механизм узнавания гидратированного Са2 + и его переноса через канал.

Все Са-каналы цитоплазматической мембраны различаются по своему вкладу в поток Са2 +, селективности и проводимости, порогу активации и инактивации и т.п. От каналов внешней мембраны существенно отличаются Са-каналы, расположенные в мембране эндоплазматического ретикулума. Рецептор 1,4,5-Ф3 представляет собой тетрамер, состоящий из одинаковых субъединиц, которые формируют неспецифическую пору для катиона. Структура этого белка не имеет ничего общего со структурой потенциалзависимого Са-канала. Рецептор Ин-1,4,5-Ф3 - это каналоформер, который является Са2 +-связывающим белком, причем ионы Са2 + при низких концентрациях его активируют, а при высоких ингибируют. Связывание Ин-1,4,5-Ф3 с рецептором кооперативно и завершается десенсибилизацией, то есть снижением чувствительности рецептора к своему агонисту. Этот канал связывает также АТФ и может фосфорилироваться цАМФ-зависимой протеинкиназой.

В мембранах эндоплазматического ретикулума функционирует еще один рецептор-каналоформер, через который в цитоплазму входит Са2 +. Это рианодиновый рецептор, который экспрессируется в возбудимых клетках и может функционировать согласованно с рецептором Ин-1,4,5-Ф3 . Как и последний, рианодиновый рецептор является тетрамером, формирует неселективную катионную пору, через которую Са2 + может выходить из ретикулума. Этот канал активируется микромолярными и ингибируется миллимолярными концентрациями Са2 +, зависит также от содержания АТФ и Mg2 +. Широко известным лигандом этого рецептора является кофеин, метилксантин растительного происхождения. Эндогенным лигандом этого рецептора, по-видимому, является циклическая АДФ-рибоза. Локальное повышение концентрации Са2 +, вызванное его входом извне, также способно активировать рианодиновый Са2 +-канал.

Взаимодействие между Са2 +-каналами внешней и внутренних мембран, Са-насосами, а также Са-связывающими белками, локализованными как в мембранах, так и в цитоплазме клетки, приводит к так называемым осцилляциям Са2 +, то есть периодическим флуктуациям его концентрации в цитоплазме (рис. 4).

В невозбудимых клетках основным триггером кальциевых осцилляций является Ин-1,4,5-Ф3 , который образуется из ТФИ при активации фосфолипазы С гормонами или факторами роста. Ин-1,4,5-Ф3 способен диффундировать от плазматической мембраны, где он образуется, до мембран эндоплазматического ретикулума за десятки секунд. Количество и концентрация образующегося Ин-1,4,5-Ф3 достаточно высоки, чтобы оккупировать все молекулы соответствующих рецепторов, однако выход Са2 + происходит только в так называемых горячих участках. Это участки переменной локализации в клетке, возникающие, как пузырьки в закипающей воде, в разных участках за счет высокой локальной концентрации Са2 +, Ин-1,4,5-Ф3 или его рецептора. Согласно существующим в настоящее время представлениям, вышедший в "горячем" участке в цитоплазму Са2 + диффундирует вдоль ретикулума и повышает в его мембранах чувствительность рецептора к Ин-1,4,5-Ф3 , а также облегчает открывание канала, тем самым вызывая перемещение фронта Са-волны. Локальное повышение концентрации Са2 + в этом участке мембраны приводит к инактивации Са-канала, в результате чего горячая точка гасится, а диффузия Са2 + генерирует новые точки выброса Са2 + из ретикулума. В гашении горячих точек участвуют также Са-насосы, транспортирующие Са2 + в ретикулум или межклеточное пространство.

В возбудимых тканях основной вход Са2 + внутрь клетки происходит через потенциалуправляемые Са2 +-каналы, которые функционально сопряжены с рианодиновыми рецепторами. В участке сопряжения этих двух типов каналов выход Са2 + приводит к распространению Са2 +-волны возбуждения рианодиновых рецепторов вдоль мембран ретикулума. За фронтом Са-волны происходит снижение уровня Са2 + вследствие того, что ретикулум в этом участке уже опустошен, поэтому не выбрасывает Са2 +, а Са-насос удаляет Са2 + из цитоплазмы. В возбудимых клетках частоту осцилляции Са2 + могут повышать как Ин-1,4,5-Ф3 , так и циклическая АДФ-рибоза или кофеин.

Интересно, что во многих типах клеток волна кальциевой осцилляции распространяется от клеточного ядра и может приобретать форму сфер или сложных спиралей. В некоторых тканях (сердце, мозг) Са-осцилляции, возникшие в одной клетке, могут вызывать осцилляцию Са2 + в соседних клетках, причем с той же частотой, что и в клетке, инициировавшей этот процесс. По-видимому, в этих тканях Са-волна может распространяться через межклеточные контакты, обладающие высокой ионной проводимостью.

В цитоплазме одиночной клетки гормоны и факторы роста практически не влияют на амплитуду повышения концентрации Са2 +, но увеличивают частоту его флуктуаций (см. рис. 4). Обычно уровень Са2 + в цитоплазме изменяется от 10- 7 до 5 " 10- 7 М, а частота от одного колебания в минуту до нескольких колебаний в секунду. Са-зависимые эффекты гормонов и факторов роста оказываются прямо пропорциональными частоте флуктуации цитоплазматического Са2 + (см. рис. 4). Это, по-видимому, можно объяснить тем, что при высокой частоте осцилляций увеличивается вероятность насыщения кальцием Са-связывающих белков. Диссоциация Са2 + из высокоаффинных участков Са-связывающих белков происходит за минуты, а Са2 + в цитоплазме осциллирует быстрее, поэтому Са-связывающие белки воспринимают частотную информацию и, подобно преобразователям переменного тока в постоянный, преобразуют ее в медленно развивающееся (за минуты или часы) изменение метаболизма, морфологии или функционального состояния клетки.

МИШЕНИ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ Са2 +

В Са-связывающих белках может быть несколько участков связывания Са2 +, между которыми проявляется положительная кооперативность. При связывании Са2 + в структуре белка может увеличиваться количество a-спиралей и часто на поверхности экспонируются функциональные группы, участвующие во взаимодействии Са-связывающего белка с так называемыми эффекторными белками. Таким образом, Са2 + вызывает взаимодействие двух белков, что приводит к изменению их активности или локализации в клетке.

Ниже приведены наиболее изученные Са-связывающие белки млекопитающих.

Знакомство с этим списком позволяет заключить, что Са2 + активирует многие катаболические процессы (гликогенолиз, липолиз, протеолиз), а также стимулирует синтез белка, мышечное сокращение и немышечную подвижность, экзоцитоз, ионный транспорт, секрецию нейромедиаторов. Молекулярные механизмы действия Са2 + на многие процессы изучены недостаточно. В частности, неизвестно, каким образом Са2 + влияет на дифференцировку, пролиферацию и программируемую смерть клетки. Показано, что кальмодулинзависимая протеинкиназа может фосфорилировать факторы транскрипции, а кальретикулин влияет на активность рецепторов глюкокортикоидов в ядре. Известно также, что внутриклеточный Са2 + стимулирует процессы апоптоза и это действие реализуется через активацию нуклеаз и протеаз, которые разрушают ДНК и хроматин. Отметим также, что подъем уровня Са2 + в цитоплазме является необходимым этапом в мейозе клетки. Слияние половых клеток также сопровождается подъемом уровня Са2 +. Для образования зиготы необходимо связывание Са2 + с кальмодулином. Без повышения концентрации Са2 + в цитоплазме митоз останавливается, а Са2 +-зависимое дефосфорилирование белков кальцинейрином переводит клеточный цикл из стадии G0 в G1 . Таким образом, ионы Са2 + контролируют метаболизм, функциональную активность и рост клеток, а также их рождение и смерть.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. Ч. 1. Классификация и структура. Ч. 2. Структура и механизм функционирования // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. ╧ 5. С. 2-16.

2. Ткачук В.А. Молекулярные механизмы эндокринной регуляции // Там же. ╧ 6. С. 16-20.

3. Филиппов П.П. Как внешние сигналы передаются внутрь клетки // Там же. ╧ 3. С. 29-34.

4. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М.: Наука, 1994.

Рецензенты статьи Н.Б. Гусев, О.Н. Кулаева

* * *

Всеволод Арсеньевич Ткачук, академик РАМН, член-корреспондент РАН, руководитель лаборатории молекулярной эндокринологии в Российском кардиологическом центре и зав. кафедрой биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины МГУ. Автор 200 научных статей, одного учебника и двух монографий по вопросам рецепции гормонов и внутриклеточной сигнализации.