TopList Яндекс цитирования
Русский переплет
Портал | Содержание | О нас | Авторам | Новости | Первая десятка | Дискуссионный клуб | Научный форум
-->
Первая десятка "Русского переплета"
Темы дня:

Чем занимались русские 4000 лет назад?

| Обращение к Дмитрию Олеговичу Рогозину по теме "космические угрозы": как сделать систему предупреждения? | Кому давать гранты или сколько в России молодых ученых?
Rambler's Top100
[ ENGLISH ] [AUTO] [KOI-8R] [WINDOWS] [DOS] [ISO-8859]


Русский переплет

ЧАЙЛАХЯН Л. М, ВЕПРИНЦЕВ Б. Н., СВИРИДОВА Т. А., НИКИТИН В. А.
("Биофизика" (том XXXII, вып. 5, 1987))
 

ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОЕ СЛИЯНИЕ КЛЕТОК В КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ

ЧАЙЛАХЯН Л. М, ВЕПРИНЦЕВ Б. Н., СВИРИДОВА Т. А., НИКИТИН В. А.

Статья посвящена обзору работ по реконструкции животных и растительных клеток, в которых используется новый физический метод - элек-тростнмулируемое слияние. Обсуждается влияние различных факторов среды на эффективность электрослияния. Подробно описываются собственные исследования авторов по реконструкции мышиных зигот сочетанием микрохирургии и электростимулирусмого слияния клеток. Рассмотрены преимущества метода электрослияния клеток по сравнению с широко используемыми способами слияния полиэтилепгликолем и вирусом Сендай. Отмечается, что этот физический метод может сыграть важную роль в развитии работ по клеточной инженерии.

Экспериментальные успехи в той или иной области биологии нередко определяются появлением новых методических подходов из смежных областей науки, способствующих решению принципиальных задач. Яркий пример этому - развитие такой области биофизики как электробиология. Успехи в понимании электрической структуры клеток и различных клеточных систем, механизмов генерации различных типов биопотенциалов и механизмов воздействия электрических и магнитных полей на биологические ткани во многом определились развитием теоретических и экспериментальных работ в электрохимии, электронике и других смежных областях физики и физикохимии.

Сейчас мы являемся свидетелями того, что достаточно простой физический прием, при котором используется непосредственное воздействие электрического тока на клеточные структуры и который приводит к слиянию клеток, может существенно повлиять на дальнейшее развитие работ в области клеточной инженерии, и в первую очередь способствовать усилению работ по реконструкции клеток. Таким образом, элск-тробиологические подходы могут оказать существенное влияние на развитие областей клеточной биологии, казалось бы весьма далеких от нее.

РЕКОНСТРУКЦИЯ КЛЕТОК - ВАЖНЫЙ ПРИЕМ В РЕШЕНИИ МНОГИХ ЗАДАЧ БИОЛОГИИ

За последние 15 лет активно развиваются работы по реконструкции клеток, причем число публикаций лавинообразно нарастает. И это естественно, так как реконструируемые клетки, формируемые из ядра и цитоплазмы различного происхождения могут использоваться для решения большого количества важнейших биологических проблем. Данное направление исследований своевременно было обобщено в монографии [I], в которой достаточно полно освещены различные стороны проблемы. В настоящий момент проблема клеточной реконструкции, на наш взгляд, вступает в новый этап в связи с появлением нового эффективного физического метода - электростимулируемого слияния клеток.

Реконструкция эмбриональных клеток и проблемы биологии развития. Реконструкция эмбриональных клеток, по существу включает в себя такую важную задачу биологии развития, как механизмы реализации генетической информации [1, 2]. Это направление призвано решить такие важные проблемы: как исследование реальной тотипотентности ге-нома клеток разного уровня дифференцировки, способность геномов к репрограммированию, исследование подходов к получению отцовских и материнских копий или клонированию, получению гибридных животных и межвидовых химер путем искусственного слияния геномов и создания "реконструированных зигот и ранних эмбрионов [З]. Реконструкция эмбриональных клеток позволяет взглянуть на взаимодействие ядра и цитоплазмы [1, 2], рецепторных структур мембраны и генома. Особое место занимают опыты по пересадке ядер опухолевых клеток в энуклеи-рованные яйцеклетки [I]. Реконструкция эмбриональных клеток открывает возможность для изучения роли внеядерной наследственности в развитии [I].

Реконструкция дифференцированных клеток и проблемы цитологии. Подобные приемы реконструкции весьма важны для выяснения механизмов деления, в частности механизмов активации хроматина при реконструкции клеток из предшественниц, находящихся на разных стадиях митотического цикла [1, 4]. Эти исследования помогают выявить механизмы корреляции тех или иных свойств клеток, например вазимосвязь между увеличением способности клетки к метастазированию и злокачественному росту с уменьшением способности к формированию межклеточных диффузионных каналов [5]. Наконец, они важны для изучения механизмов старения клетки [I].

Реконструкция клеток и проблемы реализации генетической информации криоконсервированных геномов исчезающих видов животных. При существующих методах криоконсервации и размораживания различных клеточных структур (гаметы, гонады, зародыши) в 30-50% случаев повреждается цитоплазматическая мембрана [б]. Цитоплазмати-ческая мембрана может также нарушаться при перекисном окислении мембранных липидов [7]. Вместе с тем неоднократно указывалось, что хромосомы гораздо устойчивее к процессам замораживания и размораживания. В этой связи очень существенна проблема замены поврежденной клеточной оболочки на клеточную оболочку зиготы от другого, но близкого вида. В ряде случаев очень важна возможность пересадки отдельных хромосом, например при необходимости переопределения пола. "Подобные же проблемы встают при решении задачи о роли материнской цитоплазмы для развивающихся организмов. Здесь интересны разработки методических приемов по замене цитоплазмы в целом и ее отдельных элементов. Особенно интересны указанные задачи в связи с реализацией генетической информации криоконсервированных геномов при межвидовых трансплантациях ядер. Также важны задачи по получению межлинейных и межвидовых химер путем замены одного ядра в одной из клеток на стадии двух бластомеров. Получение подобных химер может содействовать преодолению при межвидовой трансплантации эмбрионов несовместимости реципиента и донора [8].

Реконструкция клеток и биотехнологические задачи. В первую очередь имеются в виду такие комбинации частей реконструированной клетки, когда можно будет получать клетки-продуценты, способные к активному синтезу тех или иных ценных биотехнологических препаратов [9]. Для решения различных задач физиологии клетки очень важно получение " химер " на клеточном уровне, когда искусственно создаются клетки с таким сочетанием свойств, которое не встречается в естественных условиях. Например, сочетание очень больших размеров клетки, что создает хорошие условия для физиологического анализа, с синтезом мембранных рецепторов, ионных каналов и т. д., наличие которых характерно лишь для мелких клеток, трудно доступных для физиологического анализа [10]. Кроме того, уже описанные возможности при использовании реконструированных клеток, в частности зигот животных, или камбиальных клеток растений, позволяет подойти к клонированию ценных для сельского хозяйства особей [11, 12].

 

СЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН - НЕОБХОДИМЫЙ ПРОЦЕСС ПРИ РЕКОНСТРУКЦИИ КЛЕТКИ

В большинстве случаев необходимым завершающим этапом для получения реконструированных клеток является процесс слияния основных исходных элементов - цитопласта и кариопласта. Хорошо известно, что при энуклеации клеток поеле обработки их цитохалазином В с последующим выделением ядра центрифугированием или микрохирургией выделенное ядро всегда окружено цитоплазмой и поверхностной мембраной, т. е, при этом всегда формируется кариопласт [I]. В то же время безъядерная часть клетки также сохраняет непрерывную целостность-поверхностной клеточной мембраны и образует цитопласт [I]. Таким образом, при искусственном отделении ядра от цитоплазмы всегда происходит по существу деление клетки, т. е. цитоплазмы разделяющихся-частей всегда остаются полностью отделенными от наружной среды клеточной мембраной.

Это, по-видимому, главное условие удачной изоляции ядер от цитоплазмы для большинства клеток животного происхождения (у которых линейные размеры не превышают 100-150 мкм). Всякое нарушение непрерывности поверхностной клеточной мембраны при энуклеации, как правило, приводит к гибели клетки в связи с резким нарушением клеточного гомеостаза. Исключительно благоприятная роль цитохала-зина В в резком повышении клеточной устойчивости к механическим повреждениям в процессе энуклеации, вероятно, определяется, главным образом тем, что за счет де конденсации микрофиламентов клеточного цитоскелета резко повышается автономность, а в силу этого, пластичность и адаптивность поверхностной клеточной мембраны к различным механическим повреждениям.

Итак, изоляция ядер, как правило, - процесс искусственного клеточного деления. Это, в свою очередь, означает, что реконструкция новой клетки из цитопласта и кариопласта возможна только при истинном слиянии клеточных мембран, при котором вновь формируется единый объем. Без такого процесса реальная реконструкция клеток невозможна. Именно четкое понимание необходимости процесса слияния клеточных мембран позволило преодолеть методические трудности при реконструкции зигот мышей [13-14].

МЕТОД ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО СЛИЯНИЯ ПРИ РЕКОНСТРУКЦИИ ЖИВОТНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

Проблема реконструкции клеток с помощью электростимулируемого-слияния - еще совсем молодое, но бурно развивающееся направление. Ее рождение связано с работой Сеида и др. [15], выполненной в 1979 г. В этой работе было показано, что при пропускании тока через внутриклеточные электроды, введенные в два соседних протопласта, может происходить их слияние. А уже через несколько лет вышли обзоры по' данному вопросу [16-18], В последнем из них, опубликованном у нас в стране в 1984 г. [18], рассмотрено уже около двух десятков работ по электрослиянию. Правда, больше половины из них вышло из лаборатории Циммермана, родоначальника и одного из активных пропагандистов этого метода. К настоящему времени количество подобных работ резко увеличилось. Разработка метода и его использование охватывает все-новые и новые лаборатории мира.

У нас в стране инициаторами данного интересного направления явились сотрудники лаборатории, руководимой Ю. А. Чизмаджевым в Институте электрохимии АН СССР. Этому 'способствовали, во-первых, проводимые в лаборатории теоретические и экспериментальные исследования по механизмам электропробоя искусственных и естественных мембран [19-22], явления, несомненно, лежащего в основе процесса электрослняния [23-24]; во-вторых, теоретические и экспериментальные разработки непосредственно по проблеме электрослияния мембран [25-28]. Соответствующие публикации и тесные научные контакты сотрудников Института электрохимии с, биологическими институтами способствовали использованию метода электростимулируемого слияния клеток для их реконструкции в других лабораториях страны. Сейчас указанный метод уже применяется в Институте молекулярной биологии-АН СССР (лаб. А. В, Зеленина), в Институте ботаники АН УССР (лаб. Ю. Ю. Глеба), в Институте биологической физики АН СССР и- Институте проблем передачи информации АН СССР. В ближайшее время предполагается его использование в Институте физиологии растений АН СССР (лаб. Р. Г. Бутенко), во Всесоюзном научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных жи-.вотных ВАСХНИЛ (лаб. В. П. Рябых) и в ряде других биологических учреждений.

В упомянутом обзоре [18] рассмотрены работы, в которых показано, что слияние клеток с помощью электрического стимула - явление довольно универсальное. Так, было показано, что при наложении импульсов электрического поля длительностью в 40 мкс и амплитудой 4-6

∙кВ/см на суспензию микроорганизмов Dictyostelium discoideum приводит к их слиянию и появлению значительного количества многоядерных клеток (до 40 ядер) [29]. Важно подчеркнуть, что эти клетки не удается

∙сливать двумя широко распространенными для слияния методами: поли-этиленгликолем и вирусом Синдай. В других работах было показано [30, 31], что аналогичный прием по электростимуляции суспензии клеток приводит к увеличению частоты слияния протопластов дрожжей. При этом

∙отмечается, что слившиеся клетки способны к делению.

В описанных работах, а также многих других (см. [18]) проводили слияние клеток в суспензии. В данном случае предварительно перед

∙сильным импульсом тока, вызывающим слияние, необходимо каким-либо способом вызвать агрегацию клеток, чтобы клетки контактировали друг с другом. Для этих целей широко используется метод диэлектро-фореза [16, 17], при котором клетки в случае достаточно высокой их концентрации в растворе, плотно контактируют друг с другом и создают цепочки клеток вдоль силовых линий неоднородного высокочастотного электрического поля. Интересны различные модификации указанного подхода. Так, при слиянии клеток миеломы и лимфоцитов мышей вначале с помощью диэлектрофореза формировали монослой клеток миеломы с помощью специальной формы платинового электрода, а затем в ячейку вводили лимфоциты. При этом установлено, что возникающие после электрослияния клетки-гибриды хорошо растут [32],

Для получения соматических гибридов при электростимуляции были использованы и другие приемы: создание плотной суспензии с помощью центрифугирования [33], стимулирование адгезии с помощью различных химических агентов [34, 35], культивирование клеток в монослое, где естественным образом формируются межклеточные контакты, на электропроводящей подложке [36-38].

В работах [39, 40] было специально проведено сравнение эффективности электрослияния фибробластоподобных клеток при различных способах достижения мембранного контакта: 1) посредством диэлектрофо-

∙реза клеток в переменном электрическом поле, 2) с помощью центрифугирования и образования плотного клеточного осадка, 3) путем выращивания клеток на проводящей подложке и формирования двойного клеточного слоя. Показано, что наиболее эффективным оказался третий способ (индекс слияния 50-70%) и практически неэффективным - первый. Авторы объясняют это возникновением в условиях естественного формирования двойного клеточного слоя (по данным электронной микроскопии) обширных межклеточных контактов, что повышает вероятность слияния при воздействии поля. Однако использование этого способа возможно только для клеток, способных к росту и формированию контактов, поэтому авторы предполагают, что наиболее универсальным может оказаться второй способ получения мембранных контактов.

Другой важный вопрос состоит в подборе оптимальной межклеточной среды, в которой проводится электрообработка клеток. Так, имеются указания [41], что присутствие в среде одновалентных ионов в концентрации выше 20 мМ значительно понижает эффективность электрослияния. Однако в работе [39] убедительно показано, что ионная сила раствора не влияет на величину нарушения барьерных свойств мембраны при электрическом пробое, а, по-видимому, изменяет характер контактов между мембранами. В случае наличия хороших контактов между фибробластами, когда они растут на плоской подложке, наблюдается высокий индекс электрослияний при концентрациях Nad или КС1, достигающих 140 мМ.

В работах [39-41] отмечается, что электрообработка клеток в среде, содержащей 1-2 мМ Са 24 ", приводит практически к 100% -ной гибели клеток. По-видимому, в этих условиях необратимо нарушается ионный гомеостаз за счет значительного входа ионов Са 2 "*" в цитоплазму. А при обработке клеток в среде с низким содержанием Са 34" (10 мкМ) выживаемость клеток резко возрастает (до 40%). Ситуация улучшается еще больше, если после электрообработки клетки помещаются в среду, богатую ионами Na^ [39]. В работе [39] также указывается, что важным положительным компонентом среды электрообработки является сахароза (100-150 мМ), а также диализо-ванная против бескальциевого буфера сыворотка (в количестве l/s по объему). Это позволяет получить максимальный выход поликарионов, которые жизнеспособны в течение нескольких дней.

В работах [38-40, 42] указывается, что цитоскелет, вероятно, не принимает непосредственного участия в процессе слияния клеток после их электрообработки и слияния цитоплазм, характерное время которого для L-клеток ~90-120 мин, так как ни цитохалазин В и Д, ни колце-мид практически не влияют на скорость и конечный индекс слияния. В работах [38-40] также указывается, что разбавление среды после электрообработки дистиллированной водой на Уз ускоряет процесс объединения цитоплазм клеток. В работе [39] предполагается, что это связано с изменением натяжения поверхностной мембраны.

Итак, в настоящее время уже достаточно широко ведутся исследования по поиску оптимальных условий для электрослияния животных клеток. К рассмотренным здесь вопросам мы еще вернемся при обсуждении наших результатов по реконструкции эмбриональных клеток млекопитающих.

Метод электростимулируемого слияния клеток начинает широко использоваться и для растительных клеток. Для растительных протопластов Petunia inflata установлено, что полученные электростимулируе-мым слиянием гибридные клетки способны образовывать клеточные стенки и делиться [43]. Ряд интересных данных по электрослиянию растительных клеток приводится в обзоре [44]. Описано электрослияние протопластов из листьев диплоидного вида картофеля с суспензионны-ми протопластами махорки. Разная способность к слиянию протопластов. из листьев и суспензии позволила подобрать условия для получения 40- 50% гетерологических слияний, 60-70% из которых составляли бинарные (1 : 1). Отмечается, что важная модификация метода электрослияния растительных клеток состоит в возможности предварительного отбора пары протопластов, предназначенных для слияния. Это позволяет по-новому подойти к решению трудной проблемы отбора гибридных продуктов при массовом слиянии протопластов. Автор обзора [44] отмечает, что несомненное преимущество электрослияния - контролируемость процесса, увеличение числа попарно слившихся и, более того, специально выбранных для этого протопластов, привлекает к указанному методу все большее число исследователей.

Таким образом, на разнообразных типах животных и растительных клеток показана эффективность использования для их реконструкции метода электростимулируемого слияния клеток. Не случайно метод получает быстрое распространение в различных лабораториях.

Необходимо отметить, что в рассмотренных работах, где используют либо 'суспензии клеток, либо монослойную культуру, как правило, применяют способ множественного слияния клеток. Площадь электродов в этом случае всегда во много раз превышает размеры единичной клетки. Вместе с тем при реконструкции клеток в связи с переносом генетического материала оказалось целесообразным использовать метод локаль- ∙ ного электрослияния, когда два электрода непосредственно подводят к паре клеток, которые предполагается сливать. Такие приемы, например, были использованы при слиянии бластомеров ранних эмбрионов млекопитающих с формированием полиплоидных клеток [45, 46].

РЕКОНСТРУКЦИЯ ЗИГОТ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ СОЧЕТАНИИ МИКРОХИРУРГИИ И ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО СЛИЯНИЯ КЛЕТОК

Интересные результаты по применению метода электростимулируе-мого слияния клеток были получены в последнее время на эмбриональных клетках млекопитающих. В данной области имеется непосредственный опыт работы авторов, поэтому на этих исследованиях мы остановимся подробно.

Проблема пересадки ядер зиготы или реконструкция клетки - одна из центральных в биологии, так как позволяет подойти к решению ряда принципиальных вопросов биологии развития. Успехи, в этой области, достигнутые на зародышах амфибий, рыб и беспозвоночных, вселяли, в частности, уверенность в принципиальную возможность клонирования организмов [47]. Особый интерес представляют подобные исследования на зародышах млекопитающих [48]. Однако опыты по пересадке ядер у зародышей млекопитающих технически существенно сложнее, чем у зародышей рыб и амфибий.

Яйцеклетки млекопитающих оказались значительно более чувствительными к микрохирургическим манипуляциям, связанным с удалением и введением в них ядер. Инъекционный способ введения кариоплас-тов приводит, как правило, клетку к гибели. Подобные особенности зигот млекопитающих вероятнее всего, связаны с тем, что их объемные размеры в несколько тысяч раз меньше, чем объемные размеры зигот амфибий и рыб. В соответствии с этим при проколе поверхностной мембраны микроинструментом для удаления и введения ядер зиготы млекопитающих испытывают несравненно большее повреждение, чем зиготы рыб и амфибий. Такое повреждение поверхностной мембраны практически всегда приводит к гибели клетки млекопитающих в связи с необратимым нарушением гомеостаза.

В работе [13] была предложена методика, которая не требовала пе-нетрации микропипеткой цитоплазматической мембраны клетки. Введение ядра-донора в энуклеированную зиготу достигалось с помощью вируса Сендай.

Ниже мы опишем используемые нами приемы и экспериментальные условия, при которых были получены зиготы мышей, реконструированные электрослиянием. Частично эти результаты опубликованы в [49].

Эксперименты были проведены на мышах CBWA альбиносах-тетра-гибридах. В качестве приемных самок использовали гибриды Fi (СВАХ ХС57) (aqouti). Мышей получали из питомника " Светлые горы " . Одноклеточные зародыши на стадии пронуклеусов, практически лишенные кумулюса, получали от мышей CBWA первого дня беременности. Для вымывания и культивирования зигот использовали модифизированную среду Виттена [50] следующего состава: NaCI-88 мМ; КС1 -5 мМ;

КНгР04 -1.19 MM;MgSO,-7H20-l,19 мМ; СаС1з - 2мМ;Ма-лактат - 22мМ^а-пируват - 0,ЗЗмМ; МаНСОз - З мМ; Hepes-5-7 мМ; глюкоза - 1 мг/мл; BSA - 3 мг/мл; рН поддерживали в диапазоне 6,9-7,3. Среда также содержала 10 мкМ Naa34TA [51]. Для микрохирургии эту среду разбавляли на 20% дистиллированной водой с целью поддержания тур-гора клеток. Кроме того, в среду для операций добавляли цитохалазин В в дозе 5мкг/мл [52]. В специальную микрокамеру типа Фонбрюна (53] помещали 10-15 зигот в среду для микрохирургии. Время инкубации зигот в среде до операции не превышало 15 мин. Все манипуляции проводили при комнатной температуре.

Микрохирургию проводили на аппаратуре, специально разработанной ИБФ АН СССР совместно с СКВ БП АН СССР. В ее состав входили микроманипуляторы К.М-2, микрокузница, прибор для вытяжки капилляров, устройство для заточки микропипеток и видеоконтрольное устройство. Основные инструменты для проведения операций - микропипетку и микроприсоску - изготавливали из молибденового стекла. Изготовление микроприсоски осуществляли по методу Фонбрюна [53], Заточку микропипетки проводили па специальном устройстве [54]. Диаметр готового инструмента составлял 20-25 мкм.

Микрохирургическую операцию по удалению мужского и женского пронуклеусов одновременно с последующим введением полученного таким образом кариопласта под зону псллюцида энуклеированной зиготы проводили, используя приемы, описанные в работе [13].

На рис. 1 представлены этапы удаления из зигот мужского и женского пронуклеусов с образованием кариопласта.

При проведении микрохирургической операции выяснилось, что после прокола зоны пеллюцида микроииструмент внедряется в глубь клетки, не повреждая поверхностную мембрану клетки. Это определяется главным образом действием ци-тохалазина В. Клетка сохраняет жизнеспособность до тех пор, пока не нарушена целостность цитоплазматической мембраны, Кариопласт формируется за счет всасывания пронуклеусов вместе с цитоплазмой и наружной поверхностной мембраной в микропипетку. Происходит как бы искусственное деление клетки. Попытки вернуть кариопласт обратно в зиготу не удаются. Мембрана кариопласта контактирует с зиготой и может так сохраняться в течение достаточно долгого времени (1-2 суток), но слияния не происходит. При этом энукле-ированная зигота не делится, а кариопласт частично фрагментирует. Для реконструкции зиготы необходимо их истинное слияние. Для слияния такой клеточной пары были использованы электрические стимулы вместо вируса Сендай. Элсктрослияние мы проводили в той же среде, в которой оперировали зиготы.

Предполагают, что слияние двух соседних клеток при подаче на них внешнего электрического поля происходит за счет необратимого электрического пробоя контактирующих мембран [23, 24]. Очевидно, что решение этой задачи связано с поисками таких способов приложения электрического поля, при которых максимум падения напряжения приходится на мембраны в области контакта. Было опробовано несколько вариантов с использованием внеклеточных электродов. Схематично они представлены на рис. 2, а - г.

На рис. 2, и показан способ, при котором ток пропускали между большим наружным электродом 3 из вольфрама и вольфрамовой нитью 4, введенной в микропипетку 2.

Импульс тока подавали в момент, когда кариопласт, вводимый под зону пеллюцида, приходил в контакт с эну-клеированной зиготой. Во всем диапазоне использованных токов слияния не достигалось. При подаче импульсов тока внутри микроинструмента возникали достаточно сильные и направленные электрофорети-ческие смещения среды, что приводило к разрушению кариопласта. Возможно, этому способствовал и локальный нагрев.

На рис. 2, б изображен способ с использованием вольфрамового микроэлектрода 4, у которого свободен от изоляции только торец кончика диаметром 2-3 мкм. Другой электрод 3 был такой же, как и в предыдущем случае. Микроэлектрод подводили в область контакта и пропускали импульсы тока. При этом наблюдали единичные случаи слияния кариопласта с энуклеированной зиготой, однако при удалении электрода , из области контакта либо кариопласт, либо зигота разрушались. Вероятно, за счет высокой плотности тока вблизи кончика микроэлектрода происходит локальный нагрев и прилипание микроэлектрода к поверхности кариопласта или зиготы.

В следующем варианте (рис. 2, в} использовали большие электроды, когда сами электроды и расстояние между ними в несколько раз превышало размеры клетки. В большинстве случаев вскоре после слияния наблюдали гибель реконструированной зиготы. Очевидно, при таком способе необратимый пробой мембраны происходил не только в области контакта кариопласта с энуклеированной зиготой.

Наиболее удачным оказался последний вариант (рис. 2, г) с электродами, у одного из которых диаметр торца был 70-100 мкм, у другого 20-30 мкм, что примерно соответствовало размерам энуклеированной зиготы и кариопласта. Существенно, что электроды были тщательно изолированы, за исключением торцов. Доля удачных электрослияний при этом составляла 75%, а с электродами без изоляции только 25%.

При проведении основной серии опытов с использованием последнего варианта прооперированную зиготу с введенным под зону пеллюцида кариопластом помещали вплотную между двумя электродами таким образом, чтобы плоскость контакта цитопласта и кариопласта была перпендикулярна прямой, соединяющей кончики электродов. Каждую клеточную пару отдельно подвергали действию электрических стимулов. Оптимальные параметры электростимуляции были следующими: напряжение на выходе стимулятора (ЭСЛ-2) 20 В, длительность импульсов 0,1 мс, расстояние между электродами 100-150 мкм.

Специальные измерения показали, что в используемой среде при подаче импульса 20 В длительностью 0,1 мс, при котором происходит слияние на межэлектродном расстоянии, примерно равном диаметру объекта (100 мкм). падение напряжения составляет 0,6 В. Эта величина возрастала до 1 В при введении между электродами объекта. Таким образом, на каждую из четырех мембран: двух в области контакта и двух, прилегающих к электродам, приходится в среднем по ^0,25 В в начальный момент подачи импульса тока (до пробоя).

Можно предполагать, что возникновение пробоя в любой из указанных четырех мембран приведет к перераспределению потенциала, его возрастанию на остальных мембранах. Это будет способствовать возникновению пробоя в них [55]. Таким образом, при электрослиянии пробой, вероятно, возникает во всех четырех мембранах, и только в области тесного контакта мембран он необратим.

Результаты основной серии опытов по микрохирургии и слиянию приведены в таблице. Большинство клеток сливалось после одного импульса. Отдельные характерные фазы слияния показаны на рис. 3.

Можно отметить ряд моментов. Сразу же после электрического стимула наблю-дается увеличение площади контакта между кариопластом и цитоплас-том, что является начальным этапом процесса слияния. Дальнейшее протекание процесса слияния характеризуется постепенным размыванием или растворением контактирующих между собой мембран. Время между электрическим стимулом и визуально наблюдаемыми признаками начала процесса слияния варьирует от 1-15 с до 20-30 мин, т. е. на три порядка. Основное количество клеток сливается в течение 1-10 мин. К неслившимся клеткам прилагали дополнительно серию импульсов (два-три импульса с интервалом в несколько секунд), что заметно уве' личивало процент слияния.

Некоторые наши данные согласуются с наблюдениями, описанными в работах [38-40, 42]. Так, высокий процент электрослияиий, имеющий место в наших опытах (до 75%), наблюдается в присутствии цнтохала-зина В в концентрации 5 мкг/мл. Вместе с тем в специальных опытах [56] нами было показано, что при этих концентрациях цитохалазина В " жесткость " кортекса зигот понижается в десятки раз, что свидетельствует об очень сильной деполимеризации примембранных микрофиламен-тов. Это означает, что процесс электрослияния может эффективно осуществляться без участия указанных структур. Нами также было отмечено, как и в работах [38-40], что гипотония (разбавление используемой нами среды на 20-30% дистиллированной водой) облегчает процесс слияния. Возможно, это обусловлено не столько изменением натяжения мембраны [39], сколько тем обстоятельством, что начальные этапы слияния связаны с некоторым увеличением суммарного объема зиготы и кариопласта, а повышение клеточного тургора способствует указанно-му процессу. Наконец, еще один результат согласуется с данными [39]:

высокий процент слияний в наших опытах осуществляется в среде с высокой ионной силой. По-видимому, формирование обширного адгезион-ного контакта не зависит от ионного состава среды, так как зона пеллю-цида обеспечивает достаточно сильный механический прижим зиготы и кариопласта друг к другу.

Однако имеются у нас и существенные расхождения с результатами работ [39-41]. Главное из них состоит в том, что в наших опытах мы наблюдали очень высокий процент удачных слияний (75%), хотя электрообработка клеток проходила в среде, содержащей 2 мМ ионов Са 24 ". А по данным [39. 41] при таких значительных концентрациях ионов Са 24 " в среде наблюдается 100%- ная гибель клеток при электрослиянии. Можно отметить также существенные различия между нашими данными и [39] по динамике процесса слияния. В наших опытах в 30-40% случаев весь процесс слияния до полного объединения цитоплазм клеточной пары осуществлялся в пределах 1 мин, хотя в ряде случаев растягивался на десятки минут. По-видимому, имеются существенные различия на всех стадиях протекания процесса электрослияния зародышевых клеток по сравнению с фибробластоподоб-ными клетками, описанными в работе [39]. Эти различия, вероятнее всего, связаны с особенностями структурно-функциональной организации самих клеток.

 

Для проверки жизнеспособности 30 зигот мышей CBWA, реконструированных электрослиянием, были трансплантированы в яйцеводы приемным самкам Fi (СВАХ С57) по три-четыре

клетки на приемную мышь. У трех из восьми самок родилось по одному детенышу, которые отличались по цвету шерсти от собственных мышат, По росту и поведению они не отличались в дальнейшем от собственного потомства реципиентов (рис. 4).

Это позволяет сделать вывод, что электрослияние не вносит заметных нарушений в геном и может быть использовано'в широком круге задач по клеточной инженерии.

В связи с обсуждаемым нами вопросом большой интерес представляет работа [57], в которой клетки были реконструированы при использовании вируса Сендай и электростимуляции из безъядерных половинок неоплодотворенных яйцеклеток овцы и бластомеров из 8- и 16-клеточных зародышей овцы. Автор указывает при этом па явное преимущество электростимулируемого слияния. Важно также отметить, что реконструированные таким образом клетки были способны к нормальному эмбриональному развитию, так как после их трансплантации приемным самкам родились ягнята.

ПЕРСПЕКТИВЫ МЕТОДА ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО СЛИЯНИЯ КЛЕТОК

На основании уже имеющегося опыта по реконструкции различных клеток при использовании метода электростимулируемого слияния складывается впечатление, что он имеет большую будущность. Постараемся аргументировать оптимистические прогнозы.

В первую очередь хочется отметить, что на основании работы [57] и наших данных можно утверждать, что при электростимулируемом слиянии клеток геном не повреждается. Факт полного и нормального эмбрионального развития от зиготы до взрослых особей убедительный довод в пользу сохранности генома [2]. В первом приближении эти данные, по-видимому, можно распространить и на другие клетки животного и растительного происхождения, реконструированные электрослиянием.

Важная особенность метода электрослияния - его универсальность [18]. Действительно, если в основе механизма электрослияния лежит процесс пробоя липидного бислоя клеточной мембраны и образования пор, то тогда явлению электрослияния должны быть подвержены все клеточные мембраны без исключения. И действительно существуют типы клеток, которые невозможно слить с помощью полиэтиленгликоля или вируса Сендай, но которые сливаются при электростимуляции. Конечно, при этом важно помнить, что необходимым условием для электрослияния является возможность прямого контакта между мембранами клеток, которые предполагается сливать.

Существенный положительный момент метода электрослияния состоит в том, что он не связан с химическим воздействием. Действующим началом здесь является не какой-либо химический или биологический фактор, который необходимо вводить в раствор к исследуемому объекту, а электрический ток, пропускаемый через объект. В среду для электрослияния ничего дополнительного не вносится, кроме электродов, да и то на короткое время. При подаче необходимого для сливания электрического поля на клетки, как мы уже отмечали, по существу возможны два случая: либо обе клетки или одна из сливающихся клеток сразу же разрушается (в пределах 5-15 с), что означает образование у мембраны необратимого пробоя; либо слияние проходит благополучно, что означает обратимость пробоя. Во втором случае происходит, по-видимому, временное нарушение гомеостаза внутриклеточной среды за счет образования пор. Принципиально иная ситуация имеет место при действии на клетки полиэтиленгликоля или инактивированного вируса Сендай. В этом случае используемые факторы попадают внутрь клетки и могут там каким-либо образом достаточно долго и сложно взаимодействовать с внутриклеточными структурами. Не случайно есть указания, что и по-лиэтиленгликоль и вирус Сендай могут понижать жизнеспособность клеток.

Уместно также отметить еще одну важную положительную особенность рассматриваемого нами метода, которая явилась важным фактором в развитии всей электробиологии. Это - большие экспериментальные удобства в легкости и широком диапазоне строгой количественной дозировки.

При современном использовании диэлектрофореза и электрослияния в плотных клеточных суспензиях можно получать громадные многоядерные клетки, что невозможно при других способах слияния. Такие многоядерные гигантские клетки, достигающие до 1 мм, могут оказаться очень полезными для решения различных экспериментальных задач.

Укажем еще одну интересную возможность использования электро-стимулируемого слияния. С его помощью можно избирательно сливать вполне определенные клетки, что, по-видимому, малореально при химическом стимулировании слияния. Например, при получении химер необходимо слить криопласт от другой линии, введенный под зону пеллюцида двухклеточного зародыша, только с тем бластомером, у которого предварительно удалено ядро (см. рис. 5).

Такое избирательное слияние может достаточно легко контролироваться расположением электродов по отношению к исследуемой группе клеточных структур. Если расположить электроды таким образом, чтобы линия их продольных осей проходила перпендикулярно к области контакта тех клеток, которые необходимо слить (бластомер / и кариопласт), то преимущественно будет сливаться именно эта пара клеток. Возможны и другие типы вариантов локального и направленного слияния у различных клеточных структур.

Рассмотренные особенности метода электростимулируемого слияния (безопасность для генома, универсальность, чистота, технологическая простота, избирательность, строгая дозированность и ряд других) позволяют полагать, что он действительно резко расширит и ускорит исследования в области клеточной инженерии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зеленин Л. В.. Кущ А. А; Прудовский И. А. Реконструированная клетка. М.: Наука, 1982.

2. Гердон. Дж. Регуляция функции генов в развитии животных. М.: Мир, 1977.

3. Мак-Ларвн А. Химер],! млгкопптаклцих. М.: Мир, 1979.

4. Рингерц II., Сэвидж Р . Гибридные клетки. М.: Мир, 1979.

5. Лгагта R., Lowcnsn'in W- /?-//J- Mcmbr. Biol, 1977. V. 34. P. 1.

6. Пушкарь Н. С.. Капрельянц А. С; Панков Е. Я- Ультраструктура клетки при низких температурах. Kik'ii: i-iavK. думка, П78.

7. Tappet A. L.//J. Biol. Clieni. 1965. V. 217. P. 721.

8. pott H. II., Вепринцсв Б. /-/.//Успехи стр. Оиологип. 1981. Т. 91. ╧ 3.

9. Solicr D.l/^cv. Tcciinologies in Animal Breeding/Ed. B. G. Brackett et al. N. Y-: Acad. Press. 1981. P. 201.

10. Miledi R. !., Sunnku-^a K.//Biomed, Res. 1982. V. 3. P. 390.

11. Scidcl (i. ё.//Thcfi(J^no]u;?y. 1982. V. 17. Л" I. P. 23. 12- Murkcrt С. L.. Seidd G. /-.../Now Technologies in Animal Breeding/Ed, by B. Q. Brackett et al. N. Y.: Acad. Press. 1981. P. 181.

13. McGrath }., Seller ^.//Science. 1983. V. 220. ╧ 4603. P. 1300.

14. McGriHh /., S-ilk-r /3,.//Ibid. 1984. V. 226- ╧ 4d80. P. 1317.

15. Scnda М., 'laki'du I., Abe. S., Nakamura 7'.//Plant Cell. Physiol. 1979. V. 20. P. 1441.

16. Ziniirn'rniiinn [/.//Biochim. Bioplivs. Acta. 1982. V. 09-1.. P. 227.

17. Zimmennann I,'.. Vicnki'n J.iJJ. Membrane Biol. 1982. V. 67. P. 165. ;

18. Черномпрдик JI. В. /.'Успехи современной биологии. 1984. Т. 98. ╧ 3. С. 395. '

19. Chernoiiiui'tlik L. V., Sni-sharec S. !., Abidor S. G., Chlzinadzhev Yu. A-./'/Biochim- Bio-phys. Ada. 1983. V. 736. P. 2U3.

20. Чсрномордик └'/. В., Сухарев С. И; Абидор И. Г., Чизмаджев Ю. А.//Биол. мемб- 1 рты. It-81. Т. 1. С. ё2^,

21. Сухарев С. И., Черномордик Л. В., Попов С. В., Абидор И. Г-//Там же. 1985. Т. 2. С. 77.

22. Черномордик Л. В., Сухарев С. И.. Абидор И. Г.//Там же. 1985. Т. 2. С. 87.

23. Gingell В., Ginsberg L.//Membrane Fusion. Fisevier: Worth-Holland biomcdical press. 1978. P. 791.

24. Егорова Е. М., Черномордик Л. В., Абидор И. Г., Чиамадзкев Ю. Л.//Докл. АН СССР. 1981. Т. 256. ╧ 2. С. 476. i

25. Меликян Г. В., Абидор И. Г., Черномордик Л. В., Чайлахян Л. М.У/Там же. 1982. Т. 263. ╧ 4. С. 1009.

26. Melikyan G. В., Abidor I. G., Chernomordik L. V., Chailakhuan L. M//Biochim. Bio-phys. Acta. 1983. V. 730. ╧ 2. Р. 395.

27. Меликян. Г. Б., Черномордик. Л. В.. Абидор И. Г. и ор.У/Докл. АН СССР- 1983. Т. 296. ╧ 6. С. 1221.

28. Меликян Г, Б., Чизмаджев Ю. А., Черномордик Л. В. //Тез. докл. III Советско-Швей-царского симпозиума " Биологические мембраны: структура и функции ". 1983. Ташкент. С. 101.

29. Neumann E., Gerisch G., Opatz K.//Naturwissenschafteii. 1980. В. 67. S. 414.

30. Weber H., Forster W└ Berg H., Jacob H. ё.//Current Genet. 1981. V. 4. P. 165.

31. Weber H., Forster W., Jacob H. E.. Berg H./fAUg. Microbiol. 1981. В. 21. S. 555.

32. VienkenJ.. Zimmermann ё/.//FEBS Letters. 1982. V. 137. Р. II.

33. Neumann E└ Gerish G., Opatz /C.//Naturwissenschaiten. 1980. В. 67. S. '414.

34. Lo M. М└ Trong Т. У└ Conrad М. К. et al. Nature. 1984. V. 310. Р. 792.

35. Chapel M., Teissie /.. Alibert G.//FEBS Letters. 1984. V. 173. Р. 331.

36. Teissie J.. Knutsion V. P., Tsong Т. Y; Lane My/Science. 1982. V. 216. P. 537.

37. Finaz С.. Lefevre A.. Teissie f.f/J. Exp. Cell. Res. 1984. V. 150. P. 477.

38. Бандрина И. H., Сухарев С. И., Федорова Л. М. и др./Пез. докл. Всесоюз. конф . по генетике соматических клеток в культуре. 1986. М. С. 92.

39. Сухарев С. И; Бандрина И. H., Барбул А. И. и др.ЦЪяол. мембраны. 1987. Т. 4. ╧ 7. С. 766.

40. Sukharev S. !., Bandrina /. N.. Barbul A. I. et al./fStudia. biophys. 1987. Т. 120. ╧ 1. С 91.

41. Blangero С., Teissie J.//J. Membrane Biol. 1985. V. 86. P. 247. .

42. Ohno-Shosaky Т., Okada y.//Ibid. 1985. V. 85. Р. 269.

43. Zimmermann U., Scheurich P.. Pilwat G., Benz R. Angew. Chem. internal (engl. ed.). 1981. V. 20. P. 325.

44. Бутенко Р. ^.//Сельскохозяйственная биотехнология, Агропромиздат. Москва. в печати.

45. Berg //.//Bioelectrochem. and Bioenerg. 1982. V. 9. Р. 223.

46. Kubiak J. Z., Tarkowski A. /?.//Exp. Cell Res. 1985. V. 157. P. 561.

47. DiBerardino M. Ay/Differentiation. 1980. V. 17. Р. 17.

48. Васецкий С. Г.//0нтогенез. 1986. Т. 17. С. 229.

49. Свиридова Т. А., Чайлахян. Л. М., Вепринцев Б. Н└ Никитин В. А. Докл. АН СССР. 1987. Т. 295, ╧ I- С. 241.

50. Whiften W. ^.//Advances in the Biosciences. Vieweg: Pergamon Press. 1971. V- 6. P. 129.

51. Abramczuk /., Solter D└ Koprowski ff.HDev. Biol. 1977. V. 61. P. 378.

52. Hoppe P. S; Illmensee KJ/Ртос. Natl. Acad. Sd. USA. 1977. V. 74. P. 5657.

53. ФонбрюнП. Методы микроманипуляций. М.: Изд-во иностр. лит., 1951.

54. Никитин В. А. Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1986.

55. Пастушелко В. Ф.. Чизмаджев Ю. А. Биол. мембраны. 1985. Т. 2. ╧ 11. С. 1116.

56. Чайлахян Л. М., Свиридова Т. А., Вепринцев Б, Й.//Тез. докл. IX Всесоюз. симпоз. по структуре и функциям клеточного ядра. Черноголовка. 1987. С. 264.

57. Willadsen S. My/Nature. 1986. V. 320. Р. 63.

 

Русский переплет

Aport Ranker

Copyright (c) "Русский переплет"


Rambler's Top100